PCR cuantitativa para la detección del virus de la tristeza de los cítricos en Colombia
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Resumen
Se aplicó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR), usando SYBR Green para la detección específica del virus de la tristeza de los cítricos (CTV) en Colombia. Una pareja de iniciadores, diseñados a partir de secuencias conservadas en los marcos abiertos de lectura (ORF’s) 1b y 2, permitió amplificar el ARN genómico (ARNg), y un producto de 186 pb fue obtenido sin la presencia de dímeros o inespecificidad. El análisis de la curva de fusión mostró un pico entre 81 oC y 83 oC, con un coeficiente de correlación de 0,998 y una eficiencia de 99,1 %. La curva estándar se desarrolló a partir de una amplificación del producto de 186 pb y permitió realizar un análisis cuantitativo de las muestras, con un rango de detección de 1x108 hasta 1x103 copias de RNAg y con valores de coeficiente de variación bajos. La acumulación de CTV fue más alta en tejido foliar y en frutos que en corteza; entretanto, las diferencias demostradas entre varias especies de cítricos susceptibles a la infección fueron mínimas. Los resultados de este trabajo muestran que la mayor concentración de virus se encontró en el tercio superior de las plantas analizadas, seguida por el tercio bajo y, por último, el tercio medio. La qRT-PCR es un método específico y sensible de interés práctico en los procesos de detección de las enfermedades virales presentes en el cultivo de los cítricos y otros cultivos de interés comercial.
Palabras clave
Closterovirus, cuantificación absoluta, detección de patógenos vegetales, enfermedades de los cítricos, PCR en tiempo real SYBR Green
Referencias
- (1) Caicedo A., Muñoz O., Triviño A., Gómez JE. Bases para la certificación de plántulas de cítricos libres de enfermedades en Colombia. Novedades Técnicas. 2006; 7: 9-16.
- (2) Morales J., Acosta O., Tamayo P., Peñaranda J. Characterization of Citrus tristeza virus isolates from Colombia. Rev. Protección Veg. 2013; 28(1): 45-53.
- (3) Ruiz-Ruiz S., Moreno P., Guerri J., Ambros S. Discrimination between mild and severe Citrus tristeza virus isolates with a rapid and highly specific Real-Time Reverse Transcription-polymerase chain reaction method using TaqMan LNA probe. Phytopathology. 2009; 99: 307-315. DOI: http://doi.org/10.1094/PHYTO-99-3-0307. DOI: https://doi.org/10.1094/PHYTO-99-3-0307
- (4) Dawson WO., Bar-Joseph M., Garnsey SM., Moreno P. Citrus tristeza virus: Making an Ally from an Enemy. Annu. Rev. Phytopathol. 2015; 53: 137-55. DOI: http://doi.org/10.1146/annurev-phyto-080614-120012. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev-phyto-080614-120012
- (5) Oliveros GO., Martínez SN., Torres R., Acosta O. CPm gene diversity in field isolates of Citrus tristeza virus from Colombia. Archives of Virology. 2009; 154(12): 1933-1937. DOI: http://doi.org/10.1007/s00705-009-0530-6">http://doi.org/10.1007/s00705-009-0530-6. DOI: https://doi.org/10.1007/s00705-009-0530-6
- (6) Costa A., Nunes W., Zanutto C., Müller G. Stability of Citrus tristeza virus protective isolates in field conditions. Pesquisa Agropecuaria Bras. 2010; 45(7): 693-700. DOI: http://doi.org/10.1590/S0100-204X2010000700009. DOI: https://doi.org/10.1590/S0100-204X2010000700009
- (7) Ruiz-Ruiz S., Moreno P., Guerri J., Ambros S. A Real-Time RT-PCR assay for detection and absolute quantitation of Citrus tristeza virus in different plant tissues. Journal of virogical methods. 2007; 145: 96-105. DOI: http://doi.org/10.1016/j.jviromet.2007.05.011">http://doi.org/10.1016/j.jviromet.2007.05.011. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2007.05.011
- (8) Harper SJ. Citrus tristeza virus: evolution of complex and varied genotypic groups. Front. Microbiol. 2013; 4: 93. DOI: http://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00093. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00093
- (9) Febres VJ., Ashoulin L., Mawassi M., Frank A., Bar-Joseph M., Manjunath KL., Lee RF., Niblett CL. The p27 protein is present at one end of Citrus tristeza virus particles. Phytopathology. 1996; 86: 1331-1335.
- (10) Saponari M., Manjunath K., Yokomi R. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by Real-Time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virogical Methods. 2008; 147: 43-53. DOI: http://doi.org/10.1016/j.jviromet.2007.07.026. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2007.07.026
- (11) Bertolini E., Moreno A., Capote N., Olmos A., Vidal E., Pérez J., Cambra M. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in plant tissues and single aphid by Real-Time RT-PCR. Plant Pathology. 2008; 120: 177-188. DOI: http://doi.org/10.1007/s10658-007-9206-9. DOI: https://doi.org/10.1007/s10658-007-9206-9
- (12) Gómez G. Estado actual de la citricultura en cifras, p. 12-20. En: Gómez B. G, Caicedo A. A, Gil V. L, (eds.). Tecnología para el cultivo de cítricos en la región Caribe colombiana, Produmedios, Colombia, 2008. DOI: https://doi.org/10.21930/978-958-8311-91-3
- (13) Rodríguez P., Romero de Pérez G., Guzmán M. Detección del virus de la tristeza de los cítricos por serología, microscopía e hibridación in situ. Revista Colombiana de Biotecnología. 2009; XI(1): 94-106.
- (14) Satyanarayana T., Bar-Joseph M., Mawassi M., Albiach-Martí MR., Ayllón MA., Gowda S., Hilf ME., Moreno P., Garnsey SM., Dawson WO. Amplification of Citrus tristeza virus from a cDNA clone and infection of citrus trees. Virology. 2001; 280: 87-96. DOI: http://doi.org/10.1006/viro.2000.0759">http://doi.org/10.1006/viro.2000.0759. DOI: https://doi.org/10.1006/viro.2000.0759
- (15) Ananthakrishnan G., Venkataprasanna T., Roy A., Brlansky R. Characterization of the mixture of genotypes of a Citrus tristeza virus isolate by reverse transcription-quantitative real-time PCR. Journal of Virological Methods. 2010; 64(1-2): 75-82. DOI: http://doi.org/10.1016/j.jviromet.2009.12.001. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2009.12.001
- (16) Folimonova SY., Robertson CJ., Shilts T., Folimonov AS., Hilf ME. Infection with strains of Citrus tristeza virus does not exclude superinfection by other strains of the virus. J. Virol. 2010; 84: 1314-25. DOI: http://doi.org/10.1128/JVI.02075-09. DOI: https://doi.org/10.1128/JVI.02075-09
- (17) Heid CA., Stevens J., Livak KJ., Williams PM. Real time quantitative PCR. Genome Res. 1996; 6: 986-994. DOI: http://doi.org/10.1101/gr.6.10.986. DOI: https://doi.org/10.1101/gr.6.10.986
- (18) Freeman WM., Walker SJ., Vrana KE. Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential. Biotechniques. 1999; 26: 112-125. DOI: https://doi.org/10.2144/99261rv01
- (19) Bustin SA. Quantification or mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J. Mol. Endocrinol. 2002; 29: 23-29. DOI: http://doi.org/10.1677/jme.0.0290023. DOI: https://doi.org/10.1677/jme.0.0290023
- (20) Mackay IM., Arden KE., Nitsche A. Real time PCR in virology. Nucleic Acids Res. 2002; 30: 1292-1305. DOI: http://doi.org/10.1093/nar/30.6.1292. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/30.6.1292
- (21) Whelan JA., Rusell NB., Whelan MA. A method for the absolute quantification of cDNA using real-time PCR. Journal of Immunological Methods. 2003; 278: 261-269. DOI: http://doi.org/10.1016/S0022-1759(03)00223-0. DOI: https://doi.org/10.1016/S0022-1759(03)00223-0
- (22) Tan BH., Lim EA., Liaw JC., Seah SG., Yap EP. Diagnostic value of real-time capillary thermal cycler in virus detection. Expert Rev. Mol. Diagn. 2004; 4: 219-230. DOI: http://doi.org/10.1586/14737159.4.2.219. DOI: https://doi.org/10.1586/14737159.4.2.219
- (23) Roy A., Ananthakrishnan G., Hartung JS., Brlansky RH. Development Citrus tristeza virus and application of a multiplex reverse transcription polymerase chain reaction assay for screening a global collection of Citrus tristeza virus isolates. Phytopathology. 2010; 100: 1077-1088. DOI: http://doi.org/10.1094/PHYTO-04-10-0102. DOI: https://doi.org/10.1094/PHYTO-04-10-0102
- (24) Mirmajlessi S., Loit E. General principles of real-time PCR: a technology for quantitative detection of phytopathogens. Journal of medical and bioengineering. 2016; 5(1), February. DOI: https://doi.org/10.12720/jomb.5.1.49-52
- (25) Rutledge RG., Coté C. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves. Nucleic Acids Research. 2003; 31: 93. DOI: http://doi.org/10.1093/nar/gng093. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gng093
- (26) Casal J., Mateu E. Tipos de muestreo. Rev. Epidem. Med. Prev. 2003; 1: 3-7.
- (27) Lee C., Kim J., Shin SG., Hwang S. Absolute and relative qPCR quantification of plasmid copy number in Escherichia coli. Journal of Biotechnology. 2006; 123: 273-280. DOI: http://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2005.11.014. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2005.11.014
- (28) Cambra M., Gorris MT., Olmos A., Martinez MC., Roman MP., Bertolini E., Lopez A., Carbonell EA. European diagnostic protocols (DIAG-PRO) for Citrus Tristeza Virus in adult trees. In: Duran-villa N, Milne R. G., Da Graca J. V., (Eds.). En: Procedings of the 15th conference of the International Organization of citrus virologists. IOCV, Riverside, CA, 2002. DOI: https://doi.org/10.5070/C54PH9B2XR
- (29) Narváez G., Skander BS., Ayllon MA., Rubio L., Guerri J., Moreno P. A new procedure to differentiate Citrus tristeza virus isolates by hybridisation with digoxigenin-labelled cDNA probes. J. Virol. Methods. 2000; 85: 83-92. DOI: http://doi.org/10.1016/S0166-0934(99)00158-5. DOI: https://doi.org/10.1016/S0166-0934(99)00158-5
- (30) Nolasco G., de Blas C., Torres V., Ponz F. A method combining immunocapture and PCR amplification in a microtiter plate for the detection of plant viruses and subviral pathogens. J. Virol. Methods. 1993; 45: 201-218. DOI: http://doi.org/10.1016/0166-0934(93)90104-Y. DOI: https://doi.org/10.1016/0166-0934(93)90104-Y
- (31) Olmos A., Cambra M., Esteban O., Gorris MT., Terrada E. New device and method for capture, reverse transcription and nested PCR in a single closed-tube. Nucleic Acids Res. 1999; 27: 1564-1565. DOI: http://doi.org/10.1093/nar/27.6.1564. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/27.6.1564
- (32) Permar TA., Garnsey SM., Gumpf DJ., Lee RF. A monoclonal antibody which discriminates strains of Citrus tristeza virus. Phytopathology. 1990; 80: 224-228. DOI: http://doi.org/10.1094/Phyto-80-224. DOI: https://doi.org/10.1094/Phyto-80-224
- (33) Roistacher CN. Graft-transmissible diseases of citrus. En: Handbook for Detection and Diagnosis. FAO, Rome, Italy, 1991
- (34) Vela C., Cambra M., Cortés E., Moreno P., Miguet JG., Pérez de San Román C., Sanz A. Production and characterization of monoclonal antibodies specific for Citrus tristeza virus and their use for diagnosis. J. Gen. Virol. 1986; 67: 91-96. DOI: http://doi.org/10.1099/0022-1317-67-1-91. DOI: https://doi.org/10.1099/0022-1317-67-1-91
- (35) Papin JF., Vahrson W., Dittmer DP. SYBR green-based real-time quantitative PCR assay for detection of West Nile virus circumvents false-negative results due to strain variability. J. Clin. Microbiol. 2004; 42: 1511-1518. DOI: http://doi.org/10.1128/JCM.42.4.1511-1518.2004. DOI: https://doi.org/10.1128/JCM.42.4.1511-1518.2004
- (36) Mendoza A., Salazar A., Alvarado O., Cruz MA., Barrera HA. Caracterización molecular de razas severas y débiles del virus de la tristeza de los cítricos. Ciencias UANL. 2005; 8: 250-258.
- (37) Loconsole G., Saponari M., Savino V. Development of Real-Time PCR based assays for simultaneous and improved detection of citrus virus. Plant Pathology. 2010; 128: 251-259. DOI: http://doi.org/10.1007/s10658-010-9653-6. DOI: https://doi.org/10.1007/s10658-010-9653-6
- (38) Sambrook J, Fritschi EF., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989.